본 발명은 생체 내 황화수소(H2S)와 반응하여 형광 색이 변화하는 가변색 이광자 형광 프로브 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 가변색 이광자 형광 프로브를 이용하여 세포 및 생체 조직 내에 존재하는 황화수소를 이광자 현미경을 통해 정량적으로 영상화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 가변색 이광자 형광 프로브는 미토콘드리아 또는 세포질에 선택적으로 염색됨과 동시에 황화수소(H2S)와 반응하여 강한 형광 색 변화를 나타내며, 물에 대한 우수한 용해도와 작은 분자량으로 인해 세포에 쉽게 로딩될 수 있고, 60분 이상에 걸쳐 세포 및 100~200 μm 깊이의 생체 조직에서 선택적으로 황화수소를 탐지할 수 있으므로, 세포 및 생체 조직에서 미토콘드리아 또는 세포질 내부의 황화수소의 분포 및 활성을 정량적으로 영상화 할 수 있다.